Jahresbericht 2000 des Instituts für Biochemie I (Molekulare Bioenergetik)

Direktor: Prof. Dr. Gebhard von Jagow (z.Z. Dekan)
Komm. Direktor: Prof. Dr. Ulrich Brandt

1. Mitarbeiter des Ärztlichen-/Wissenschaftlichen Dienstes

Landesbedienstete: Prof. Dr. U. Brandt, Prof. Dr. P. Geck, Prof. Dr. H. Schägger, Dr. S. Kerscher, Dr. K. Zwicker, Dr. S. Dröse, Dr. V. Zickermann

Drittmittelbeschäftigte: Dipl.-Biol. A. Eschemann, Dipl.-Chem. A. Garofano, Dipl.-Chem. L. Grgic, Dipl.-Chem. A. Stroh

2. Lehre

Über die Pflichtveranstaltungen im Biochemie-Unterricht für Mediziner hinaus wurden folgende Unterrichtsveranstaltungen für Naturwissenschaftler durchgeführt:

-      Seminar für Doktoranden zu aktuellen Problemen der Molekularen Bioenergetik

-      Beteiligung an der Vorlesung im Graduiertenkolleg „Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion“

3. Forschung

Über ihre Funktion als Kraftwerke der Zelle hinaus spielen Mitochondrien eine Schlüsselrolle bei Apoptose, Alterungsprozessen und vielen ererbten und erworbenen Krankheiten. Am Institut für Biochemie I erforschen wir die molekularen Grundlagen mitochondrialer Funktion und Dysfunktion.

Forschergruppe Prof. Dr. Brandt:

Der mitochondriale Komplex I trägt beim Menschen zu 40% des Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran bzw. der mitochondrialen ATP-Synthese bei. Zahlreiche Enzephalo­myopathien und degenerative Erkrankungen des ZNS entstehen durch Mutationen in mitochondrialen oder nukleären Genen für Komplex I-Untereinheiten.

Die mitochondriale Atmungskette der obligat aeroben Hefe Y. lipolytica ähnelt der Atmungskette der Säugetiere und des Menschen, da sie, im Gegensatz zur Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, einen aus mindestens 30 Untereinheiten bestehenden Komplex I enthält. Y. lipolytica, wurde daher in der Arbeitsgruppe als neuer Modellorganismus zur genetischen Analyse des Komplex I entwickelt. Die Gene für sieben nukleär codierte, hochkonservierte Untereinheiten wurden isoliert und sequenziert. Für sechs dieser Gene wurden Nullmutanten durch homologe Rekombination mit einem genetisch markierten Deletionsallel erzeugt. Das gesamte mitochondriale Genom, welches die Gene für sieben weitere hochkonservierte Untereinheiten enthält, wurde kloniert und vollständig sequenziert.

Y. lipolytica besitzt außerdem eine alternative, nicht protonenpumpende NADH-Dehydrogenase. NDH2, das Gen für dieses Enzym, wurde kloniert, sequenziert und deletiert. Durch Studien an intakten Mitochondrien konnte gezeigt werden, dass Y. lipolytica im Gegensatz zu anderen Pilzen nur eine externe, jedoch keine interne NADH-Dehydrogenase besitzt. Durch die N-terminale Anheftung einer mitochondrialen Lokalisationssequenz an das NDH2-Leseraster konnte interne Expression der alternativen NADH-Dehydrogenase erreicht werden. Nur die interne, nicht aber die externe Form des alternativen Enzyms kann die Elektronentransportfunktion des Komplex I ersetzen. Sie bewirkt Resistenz gegenüber Inhibitoren von Komplex I und das Überleben von Komplex I-Nullmutanten.

Für Komplex I aus Y. lipolytica wurden zwei verschiedene Reinigungsverfahren entwickelt. Nach Extraktion der mitochondrialen Membranen mit Laurylmaltosid wird in zwei chromatographischen Schritten (Ionentausch- und Gelfiltration) eine hochreine Enzympräparation erhalten. Die Anheftung einer „His-tag“-Sequenz an die 30kDa Untereinheit ermöglicht eine noch schnellere und effizientere Reinigung über Ni-Affinitätschromatographie. Rekonstitution in Liposomen führt zum Aufbau eines Protonengradienten. EPR-spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass das bisher nur im Komplex I aus Säugetieren nachgewiesene Eisen-Schwefel Zentrum N5 auch im Hefe-Komplex I vorhanden ist. In Zusammenarbeit mit Prof. Kühlbrandt (MPI für Biophysik, Frankfurt) wurde begonnen den isolierten Komplex mit Hilfe der kryo-elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalyse zu untersuchen um 2D und 3D Strukturinformationen mit einer von Auflösung ca. 20 Å zu erhalten.

Mehrere Mutagenese-Studien an Komplex I von Y. lipolytica wurden durchgeführt. Die funktionelle Bedeutung von konservierten sauren Aminosäuren in der „PSST-homologen“ Untereinheit von Komplex I konnte demonstriert werden. Individuelle Mutationen zeigten erniedrigte katalytische Raten, veränderte Affinität zu Komplex I-Hemmstoffen oder Strukturveränderungen am Eisen-Schwefel Zentrum N2. Punktmutationen, die dem Leigh Syndrom zugrunde liegen, wurden in Y. lipolytica rekonstruiert, die mutanten Enzyme gereinigt und in vitro charakterisiert. Der Vergleich mit dem Effekt von Mutationen, die das LHON Syndrom zur Folge haben, erlaubt einen ersten Ansatz zur Klassifizierung und zur molekularen Diagnostik von Komplex I Defekten.

Durch den Vergleich mit entfernt mit Komplex I verwandten Enzymen, den bakteriellen [NiFe] Hydrogenasen konnte zum ersten Mal ein Modell für das katalytische Zentrum von Komplex I ent­wickelt werden. Durch Mutagenese derjenigen Aminosäuren in Komplex I, die den Cystein-Liganden des [NiFe] Zentrums und anderen hochkonservierten Aminosäuren in den [NiFe] Hydrogenasen entsprechen, konnte dieses Modell gestützt werden. Die Daten lassen den Schluss zu, dass das kata­lytische Zentrum von Komplex I evolutionär direkt aus dem [NiFe] Zentrum der Hydrogenasen her­vorgegangen ist und stützen das von Brandt entwickelte mechanistische Modell für die direkte Kopplung der Protonen-Translokation und Ubichinon-Reduktion in Komplex I.

Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 und durch ein Doktoranden-Stipen­dium des DFG-Graduiertenkollegs "Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion", sowie durch das "Human Frontiers of Science" Program, den Fonds der Chemischen Industrie und eine Kooperation mit der Aventis Crop Science AG, Frankfurt gefördert.

Forschergruppe Prof. Dr. Geck:

In Zusammenarbeit mit H. Petrowski (ZChir) wurden Untersuchungen zu biochemischen Verände­rungen während und nach kalter Ischämie bei Rattenlebern fortgesetzt. Methoden zur Messungen der Pyruvatdehydrogenase-Aktivität unter verschiedenen Stoffwechsellagen und in Zellhomogenaten wurden verbessert.

Forschergruppe Prof. Dr. Hermann Schägger:

1) Die Atmungsketten von Hefen und Säugern bestehen nicht aus diffusiblen Einzelkomplexen, wie bisher angenommen wurde, sondern aus definiert zusammengesetzten Superkomplexen, die ihrerseits zu einem Netzwerk von Superkomplexen assoziieren. 2) In der ATP-Synthase des Acetobacterium woodii bilden 3 verschiedene c-Untereinheiten ein gemischtes c-Oligomer. 3) Die Chloroplasten ATP-Synthase wurde isoliert und zwei-dimensional kristallisiert. 4) Die Protonen-transportierenden NADH Dehydrogenasen aus Rinderherzmitochondrien und aus der Hefe Yarrowia lipolytica wurden isoliert und charakterisiert. 5) Eine putative o-Methyltransferase akkumuliert bei der Alterung von Podospora anserina.

Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) und vom Fonds der Chemischen Industrie gefördert.