Direktor: Prof. Dr. Gebhard von Jagow (z.Z. Dekan und Ärztlicher Direktor)

Komm. Direktor: Prof. Dr. Ulrich Brandt

Die mitochondriale Atmungskette der obligat aeroben Hefe Yarrowia lipolytica ähnelt der Atmungskette der Säugetiere und des Menschen, da sie, im Gegensatz zu der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, einen aus mindestens 30 Untereinheiten bestehenden Komplex I enthält. Y. lipolytica wird daher in der Arbeitsgruppe als neuer Modellorganismus zur genetischen Analyse des Komplex I entwickelt. Die Gene für sieben nukleär codierte, hochkonservierte Untereinheiten wurden isoliert und sequenziert. Für sechs dieser Gene wurden Nullmutanten durch homologe Rekombination mit einem genetisch markierten Deletionsallel erzeugt. Das gesamte mitochondriale Genom, welches die Gene für sieben weitere hochkonservierte Untereinheiten enthält, wurde kloniert, die Sequenzierung ist zu etwa 90% abgeschlossen.

Y. lipolytica besitzt außerdem eine alternative, nicht protonenpumpende NADH-Dehydrogenase. NDH2, das Gen für dieses Enzym wurde kloniert, sequenziert und deletiert. Durch Studien an intakten Mitochondrien konnte gezeigt werden, dass Y. lipolytica, im Gegensatz zu anderen Pilzen nur eine externe, jedoch keine interne NADH-Dehydrogenase besitzt. Durch die N-terminale Anheftung einer mitochondrialen Lokalisationssequenz an das NDH2-Leseraster konnte eine interne Expression der alternativen NADH-Dehydrogenase erreicht werden. Nur die interne, nicht aber die externe Form des alternativen Enzyms kann die Elektronentransportfunktion des Komplex I ersetzen. Sie bewirkt Resistenz gegenüber Inhibitoren von Komplex I und das Überleben von Komplex I-Nullmutanten.

Mit der Erzeugung von Punktmutationen im Komplex I von Y. lipolytica wurde begonnen. Diese Arbeiten bewiesen die funktionelle Bedeutung von konservierten sauren Aminosäuren in der PSST-homologen Untereinheit von Komplex I. Individuelle Mutationen zeigten erniedrigte katalytische Raten, veränderte Affinität zu Komplex I-Hemmstoffen oder Strukturveränderungen am Eisen-Schwefel Zentrum N2.

Der Komplex I von Bos taurus wurde aus mitochondrialen Membranen mit Triton X-100 differentiell solubilisiert und über Hydroxylapatit- und DEAE Biogel A Agarose-Säulenchromatographie in Anwesenheit von Detergenz isoliert. Durch den Wechsel von Triton X-100 auf Laurylmaltosid auf der Biogel A Säule erhielt man einen voll hemmbaren Komplex I mit ca. 80 % Proteinreinheit. Die abschließende Gelfiltration über eine TSKgel G 4000 SW Säule lieferte eine Komplex I Monomerfraktion von 99 % Proteinreinheit mit einem FMN und 23 Eisen pro Komplex sowie allen aus SMP bekannten Eisen-Schwefel Zentren. Nach Rekonstitution des Komplex I in Liposomen konnte der Aufbau eines Protonengradienten nachgewiesen werden.

Auch für Komplex I aus Y. lipolytica wurden Reinigungsverfahren entwickelt. Nach Extraktion der mitochondrialen Membranen mit Laurylmaltosid wird in zwei chromatographischen Schritten (Ionentausch- und Gelfiltration) eine hochreine Enzympräparation erhalten. Die Anheftung einer „His-tag"-Sequenz an die 30kDa Untereinheit ermöglicht eine noch schnellere und effizientere Reinigung über Ni-Affinitätschromatographie.

Der Hefe-Komplex wurde auf seine Untereinheitenzusammensetzung hin untersucht. In Zusammenarbeit mit Prof. Kühlbrandt (MPI für Biophysik, Frankfurt) wurde begonnen den isolierten Komplex mit Hilfe der kryo-elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalyse zu untersuchen, um Strukturinformationen im Bereich von ca. 20 Å Auflösung zu erhalten.

Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 und durch ein Doktoranden-Stipendium des DFG-Graduiertenkollegs "Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion", sowie durch das "Human Frontiers of Science" Program und eine Kooperation mit der AgrEvo GmbH, Frankfurt gefördert.

Forschergruppe Prof. Dr. Geck:

In Zusammenarbeit mit H. Petrowski (ZChir) wurden Untersuchungen zu biochemischen Veränderungen während und nach kalter Ischämie bei Rattenlebern fortgesetzt. Methoden zur Messungen der Pyruvatdehydrogenase-Aktivität unter verschiedenen Stoffwechsellagen und in Zellhomogenaten wurden verbessert.

Forschergruppe Prof. Dr. Schägger

Die mitochondriale ATP-Synthase aus Hefe wurde in dimerer Form isoliert. Es wurden vier neue Proteine identifiziert und charakterisiert. Deletion des Gens der neuen Untereinheit j führt zum Verlust der Assemblierung der ATP-Synthase. Deletion der Gene der dimer-spezifischen Untereinheiten e und g erlaubt die Assemblierung einer monomeren ATP-Synthase, nicht jedoch der dimeren Form.

Das humane nephrotische Syndrom ist durch funktionelle Störungen von Mitochondrien und verringerte Expression von Genen mitochondrialer OXPHOS Proteine charakterisiert. Eine 4-Basen-Paar-Deletion im mitochondrialen Cytochrom b Gen ist Ursache eines Parkinson/ MELAS Überlappungs-Syndroms.

Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) gefördert.

Forschergruppe PD Dr. Link:

Zur Untersuchung der Funktion des "Rieske"-Eisen-Schwefel-Proteins des mitochondrialen Cytochrom bc₁-Komplexes wurden in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. B.L. Trumpower (Dartmouth Medical School, Hanover/NH) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae gerichtete Mutanten untersucht, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, deren Seitengruppen Wasserstoffbrücken zum Eisen-Schwefel-Zentrum bilden. In diesen Mutanten korrelierte ein erniedrigtes Redoxpotential des "Rieske"-Proteins mit einer verminderten Elektronentransportaktivität des bc₁-Komplexes. Spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass in den Mutanten die Struktur des Proteins erhalten war, aber die Elektronenverteilung Unterschiede zum Wildtyp-Protein aufwies. Während die Chinon-Bindung des bc₁-Komplexes nicht gestört war, konnten Unterschiede in der Bindung des Hemmstoffes Stigmatellin festgestellt werden. Dieser Hemmstoff kann als ein Strukturanaloges des Semichinons gelten, das als Zwischenzustand bei der Oxidation des Substrates Hydrochinon auftritt. Die unterschiedliche Stigmatellin-Binding in den Mutanten deutet an, dass der Verlust der Aktivität des bc₁-Komplexes durch eine verringerte Stabilität des intermediären Semichinons erklärt werden kann.