Institut für Biochemie I (Molekulare Bioenergetik)

Direktor: N.N.

Komm. Direktor: Prof. Dr. Ulrich Brandt

1. Mitarbeiter des Ärztlichen-/Wissenschaftlichen Dienstes

Landesbedienstete: Prof. Dr. U. Brandt, Prof. Dr. H. Schägger, Dr. S Dröse, Dr. S. Kerscher, Dr. Z. Mehrdad, Dr. K. Zwicker, Dr. V. Zickermann

Drittmittelbeschäftigte: Dipl.-Chem. A. Abdrakhmanova, Dipl.-Biol. A. Eschemann, Dipl.-Chem. A. Garofano, Dipl.-Chem. L. Grgic, Dipl.-Chem. A. Stroh

2. Medizinisches Leistungsangebot

entfällt

3. Forschung

Über ihre Funktion als Kraftwerke der Zelle hinaus spielen Mitochondrien eine Schlüsselrolle bei Apoptose, Alterungsprozessen und vielen ererbten und erworbenen Krankheiten. Am Institut für Biochemie I erforschen wir die molekularen Grundlagen mitochondrialer Funktion und Dys­funktion.

Forschergruppe Prof. Dr. Brandt:

Komplex I des Menschen erzeugt 40% des Protonengradienten über die innere Mitochondrien­membran, der die Triebkraft der mitochondrialen ATP-Synthese darstellt. Zahlreiche Enzephalo­myopathien, Kardiomyopathien und degenerative Erkrankungen des ZNS beruhen auf ererbten oder erworbenen Defekten in Komplex I.

Da Komplex I in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae fehlt, wurde die obligat aerobe Hefe Y. lipolytica in der Arbeitsgruppe als neuer Modellorganismus zur genetischen Analyse des Komplex I entwickelt. Das gesamte mitochondriale Genom, welches die Gene für sieben hochkonservierte Untereinheiten enthält, wurde in Zusammenarbeit mit Prof. C. Gaillardin und S. Casaregola (INRA, Paris, Frankreich) kloniert und vollständig sequenziert. Unter Federführung eines internationalen Konsortiums, bestehend aus der Forschergruppe Prof. Dr. Brandt und sechs weiteren Gruppen, wurde die Rohversion der genomischen Sequenz von Y. lipolytica fertig gestellt.

Die Gene für insgesamt acht nukleär codierte, hochkonservierte Untereinheiten von Komplex I wurden isoliert, sequenziert und jeweils durch homologe Rekombination mit genetisch markierten Deletionsallelen ausgeschaltet. Eine Komplementation mit gerichteten Mutationen wird durch die Entwicklung replikativer Plasmide ermöglicht. Die Anheftung einer „His-tag“-Sequenz an die 30kDa Untereinheit erlaubt eine schnelle und effiziente Reinigung von Komplex I über Ni²⁺-Affinitätschromatographie. Neben Komplex I Y. besitzt lipolytica eine alternative, nicht protonen­pumpende NADH-Dehydrogenase (NDH2), deren aktives Zentrum zur Außenseite der inneren Mitochondrienmembran weist. Durch die N-terminale Anheftung einer mitochondrialen Lokalisati­onssequenz konnte die Expression des Enzym auf der Innenseite der inneren Mitochondrien­membran erreicht werden. Nur die interne, nicht aber die externe Form des alternativen Enzyms kann die Elektronentransportfunktion des Komplex I ersetzen und ermöglicht so das Überleben von Komplex I-Nullmutanten. Um ein Screening-System für Mutationen in Komplex I zu entwickeln, wurde die interne Version von NDH2 unter die Kontrolle des Promotors des Isocitrat-Lyase Gens von Y. lipolytica gebracht, der durch Wechsel des Substrats reguliert werden kann.

Die Arbeiten zur Mutagenese in der Region des Ubichinon-Reduktionszentrums, des „catalytic core“ von Komplex I wurden fortgesetzt. Hierbei wurde insbesondere die Funktion konservierter saurer Reste in der PSST Untereinheit untersucht. In Zusammenarbeit mit Dr. P. Rustin und P. Bénit (INSERM U393, Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, Frankreich) wurde begonnen, menschliche Mutationen in den 24 kDa und 30 kDa Untereinheiten von Komplex I zu rekonstruie­ren und in vitro zu charakterisieren.

In Zusammenarbeit mit Prof. M. Radermacher, Dr. T. Ruiz (University of Vermont, USA), Dr. C. Hunte und M. Bostina (MPI für Biophysik, Frankfurt) wurde Komplex I mit Hilfe der kryo-elektro­nenmikroskopischen Einzelpartikelanalyse untersucht, um 2D und 3D Strukturinformationen mit einer von Auflösung ca. 20 Å zu erhalten. Außerdem wurden konformationsspezifische mono­klonale Antikörper erzeugt und zur Aufklärung der Positionen einzelner Untereinheiten innerhalb des Enzyms eingesetzt. Ein überraschendes Ergebnis dieser Arbeiten war, dass ein Epitop der 49 kDa Untereinheit, die am „catalytic core“ zentral beteiligt ist, ca. 70-80 Å von der mitochondri­alen Membran entfernt lokalisiert ist. Damit erscheint ein indirekter Protonen-Pumpmechanismus für Komplex I wahrscheinlich.

Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472, den Fonds der Chemischen Industrie und eine Kooperation mit der Aventis Pharma GmbH, Frankfurt gefördert.

Forschergruppe Prof. Dr. Hermann Schägger:

Unser Arbeitsgebiet "Oxidative Phosphorylierung" umfasste Themen der biochemischen und klinischen Grundlagenforschung: 1) Aufklärung der funktionellen Rolle der Respirasom-Bildung (der Assoziation von Atmungskettenkomplexen zu Superkomplexen in der mitochondrialen Membran) und der Notwendigkeit von Cardiolipin zur Stabilisierung dieser Respirasome. 2) Unter­suchung von Redox-induzierten Übergängen im Komplex III der Atmungskette mit der Perfusions-induzierten ATR-FTIR Spektroskopie. 3) Isolierung, Charakterisierung und elektronenmikrosko­pische Einzelpartikelanalyse des Komplexes I aus Aquifex aeolicus. 4) Wir konnten zeigen, dass bestimmte Nieren-Tumore (Oncozytome) einen spezifischen Defekt des Atmungskettenkomplexes I aufweisen. Die Spezifität des Defektes, der ohne Ausnahme in allen Onczytomen anzutreffen war, und die gleichzeitig gesteigerte mitochondriale Proliferation, deuten auf einen Komplex I-Defekt als primäre Ursache dieser Nierentumore hin. Als weitere Themen wurden bearbeitet: 5) Die Charakte­risierung der Benzoat-Coenzym A Ligase aus Thauera aromatica und 6) Die Entwicklung einer Strategie zur temporären Verknüpfung von Kohlenhydraten mit Cyclopeptiden zur Analyse von multivalenten Neoglycopeptiden.

Diese Themen wurden in Zusammenarbeit mit zahlreichen Kollegen aus dem In- und Ausland bearbeitet (siehe Publikationen). Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) und des SFB 628 (Functional Membrane Proteomics) gefördert.

4. Lehre

Über die Pflichtveranstaltungen im Biochemie-Unterricht für Mediziner hinaus wurden folgende Unterrichtsveranstaltungen für Naturwissenschaftler durchgeführt:

-     Seminar für Doktoranden zu aktuellen Problemen der Molekularen Bioenergetik

-     Beteiligung an der Vorlesungsreihe „Ausgewählte Themen der molekularen Medizin und Grund­lagenforschung“, veranstaltet von Arbeitsgruppen aus dem Klinikum und dem Georg-Speyer-Haus.

Forschungsoutput

1. Publikationen

1.         Bénit P., Beugnot R., Chretien D., Giurgea I., de Lonlay-Debeney P., Issartel J.P., Kerscher S., Rustin P., Rötig A., Munnich A. (2003) Mutant NDUFV2 subunit of mitochondrial complex I causes early onset hypertrophic cardiomyopathy and encephalopathy. HUMAN MUTAT 21: 582-586.

2.         Brandt U., Kerscher S., Dröse S., Zwicker K., and Zickermann V. (2003) Proton pumping by NADH:ubiquinone oxidoreductase. A redox driven conformational change mechanism? FEBS LETT, 545:9-17.

3.         Garofano A., Zwicker K., Kerscher S., Okun P., and Brandt U. (2003) Two aspartic acid residues in the PSST-homologous NUKM subunit of complex I from Yarrowia lipolytica are essential for catalytic activity, J BIOL CHEM, 278: 42435-42440.

4.         Iwaki M., Giotta L., Akinsiku A.O., Schägger H., Fisher N., Breton J., and Rich P.R. (2003) Redox-induced transitions in bovine cytochrome bc₁ complex studied by perfusion-induced ATR-FTIR spectroscopy. BIOCHEMISTRY-US 42:11109-11119.

5.         Kessl J.J., Lange B.B., Merbitz-Zahradnik T., Zwicker K., Hill P., Meunier B., Hunte C., Meshnick S., and Trumpower B.L. (2003) Molecular basis for atovaquone binding to the cytochrome bc₁ complex, J BIOL CHEM, 278: 31312-31318.

6.         Merbitz-Zahradnik T., Zwicker K., Nett J.H., Link T.A., Trumpower B.L. (2003) Elimination of the disulfide bridge in the Rieske iron-sulfur protein allows assembly of the [2Fe-2S] cluster into the Rieske protein but damages the ubiquinol oxidation site in the cytochrome bc₁ complex, BIOCHEMISTRY-US, 42:13637-13645.

7.         Peng G., Fritzsch G., Zickermann V., Schägger H., Mentele R., Lottspeich F., Bostina M., Radermacher M., Huber R., Stetter K.O., and Michel H. (2003) Isolation, characterization and electron microscopic single particle analysis of the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus. BIOCHEMISTRY-US 42:3032-3039.

8.         Pfeiffer K., Gohil V., Stuart R.A., Hunte C., Brandt U., Greenberg M.L. and Schägger H. (2003) Cardiolipin stabilizes respiratory chain supercomplexes, J BIOL CHEM, 278: 52873-52880.

9.         Schühle K., Gescher J., Feil U., Paul M., Jahn M., Schägger H. and Fuchs G. (2003) Benzoate-conenzyme A ligase from Thauera aromatica: an enzyme acting in anaerobic and aerobic benzoate pathways, J. BACTERIOL 185: 4920-4929.

10.     Schweitzer C., Mehrdad Z., Noll A., Grabner E.W., Schmidt R. (2003) Mechanism of photosensitized generation of singlet oxygen during oxygen quenching of triplet states and the general dependence of the rate constants and efficiencies of O-2((1)Sigma(+)(g)), O-2((1)Delta(g)), and O-2((3)Sigma(-)(g)) formation on sensitizer J PHYS CHEM A, 107: 2192-2198.

11.     Simonnet H., Demont J., Pfeiffer K., Guenaneche L., Bouvier R., Brandt U., Schägger H., and Godinot V. (2003) Mitochondrial complex I is deficient in renal oncocytomas. CARCINOGENESIS, 24:1461-1466.

12.     Wittmann V., Seeberger S., and Schägger H. (2003) Temporary attachment of carbohydrates to cyclopeptide templates: a new strategy for single-bead analysis of multivalent neoglycopeptides, TETRAHEDRON LETT 44: 9243-9246.

13.     Zickermann V., Bostina M., Hunte C., Ruiz T., Radermacher M., and Brandt U. (2003) Functional implications from an unexpected position of the 49 kDa subunit of complex I. J BIOL CHEM, 276:29072-29078.

2. Lehr- und Handbücher, Monographien

3. Herausgeberschaft und Mitgliedschaft im Editorial Board einer Zeitschrift

Forschungsinput

Begutachtete Drittmittel 2003