Jahresbericht 2001 des Instituts für Biochemie I (Molekulare Bioenergetik)

Direktor: Prof. Dr. Gebhard von Jagow (z.Z. Dekan)

Komm. Direktor: Prof. Dr. Ulrich Brandt

1. Mitarbeiter des Ärztlichen-/Wissenschaftlichen Dienstes

Landesbedienstete: Prof. Dr. U. Brandt, Prof. Dr. P. Geck, Prof. Dr. H. Schägger, Dr. S. Dröse, Dr. S. Kerscher, Dr. V. Zickermann, Dr. K. Zwicker

Drittmittelbeschäftigte: Dipl.-Biol. A. Eschemann, Dipl.-Chem. A. Garofano, Dipl.-Chem. L. Grgic, Dipl.-Chem. N. Kashani-Poor , Dipl.-Biol. A. Stroh

 

2. Lehre

Über die Pflichtveranstaltungen im Biochemie-Unterricht für Mediziner hinaus wurden folgende Unterrichtsveranstaltungen für Naturwissenschaftler durchgeführt:

-      Seminar für Doktoranden zu aktuellen Problemen der Molekularen Bioenergetik

-      Beteiligung an der Vorlesung im Graduiertenkolleg „Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion“

-      Beteiligung an der Graduierten-Vorlesung „ Ausgewählte Themen der molekularen Medizin und Grundlagenforschung“

 

3. Forschung

Über ihre Funktion als Kraftwerke der Zelle hinaus spielen Mitochondrien eine Schlüsselrolle bei der Apoptose, vielen ererbten und erworbenen Krankheiten und Alterungsprozessen. Am Institut für Biochemie I erforschen wir die molekularen Grundlagen mitochondrialer Funktion und Dysfunktion.

Forschergruppe Prof. Dr. Brandt:

Der mitochondriale Komplex I trägt beim Menschen mit 40% zum Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran und damit zur mitochondrialen ATP-Synthese bei. Mutationen in mito­chondrialen oder nukleären Genen für Komplex I-Untereinheiten führten zu Kardiomyopathien und degenerativen Erkrankungen des ZNS.

Die mitochondriale Atmungskette der obligat aeroben Hefe Yarrowia lipolytica ähnelt der Atmungs­kette des Menschen. Im Gegensatz zur Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein aus mindestens 30 Untereinheiten bestehender Komplex I vorhanden. Y. lipolytica wurde daher in der Arbeitsgruppe als neuer Modellorganismus zur genetischen Analyse des Komplex I entwickelt. Die Gene für sieben nukleär codierte, hochkonservierte Untereinheiten wurden isoliert und sequenziert. Nullmutanten wurden durch homologe Rekombination mit genetisch markierten Deletionsallelen erzeugt. Das mito­chondriale Genom, welches die Gene für sieben weitere hochkonservierte Untereinheiten enthält, wurde in Zusammenarbeit mit Prof. C. Gaillardin, Paris als ein erster Schritt im Rahmen des Y. lipolytica Genom - Projektes vollständig sequenziert und annotiert.

Y. lipolytica besitzt außerdem eine alternative, nicht protonenpumpende NADH-Dehydrogenase (NDH2), deren katalytisches Zentrum zur externen Seite der inneren Mitochondrienmembran zeigt. Durch Anheftung einer mitochondrialen Lokalisationssequenz an ein verkürztes NDH2-Leseraster konnte eine interne Expression erreicht werden. Nur die interne, nicht aber die externe Form von NDH2 kann die Elektronentransportfunktion des Komplex I ersetzen. Sie bewirkt Resistenz gegen­über Inhibitoren von Komplex I und das Überleben von Komplex I-Nullmutanten. Auf der Suche nach der Ubichinon-Bindungstelle wurde eine gerichtete Mutagenese von NDH2 begonnen.

Für Komplex I aus Y. lipolytica wurden zwei verschiedene Reinigungsverfahren entwickelt. Nach Extraktion der mitochondrialen Membranen mit Laurylmaltosid wird in zwei chromatographischen Schritten (Ionentausch- und Gelfiltration) eine hochreine Enzympräparation erhalten. Die Anheftung einer „His-tag“-Sequenz an die 30kDa Untereinheit ermöglicht eine noch schnellere und effizientere Reinigung über Ni-Affinitätschromatographie. Rekonstitution in Liposomen führt zum Aufbau eines Protonengradienten. EPR-spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass das bisher nur im Komplex I aus Säugetieren nachgewiesene Eisen-Schwefel Zentrum N5 auch im Hefe-Komplex I vorhanden ist. In Zusammenarbeit mit Prof. Kühlbrandt (MPI für Biophysik, Frankfurt) wurde die kryo-elektronen­mikroskopische Einzelpartikelanalyse von Komplex I weitergeführt. Bisher wurden 3D Struktur­informationen mit einer Auflösung von ca. 20 Å erhalten. Monoklonale Antikörper gegen einzelne Untereinheiten von Komplex I aus dem Rind und aus Y. lipolytica wurden isoliert. Mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie wurde begonnen, die Lage dieser Untereinheiten innerhalb des Komplex I zu untersuchen.

Mehrere Untereinheiten von Komplex I sind evolutionär verwandt mit Untereinheiten von bakteri­ellen [NiFe] Hydrogenasen und spielen eine wichtige Rolle bei der katalytischen Funktion des Enzyms. Dies konnte unter anderem durch Mutagenese-Studien in Y. lipolytica gezeigt werden. Mutationen, die konservierte saure Aminosäuren in der „PSST“-homologen Untereinheit betreffen, zeigten erniedrigte katalytische Raten, veränderte Affinität zu Komplex I-Hemmstoffen oder Strukturveränderungen am Eisen-Schwefel Zentrum N2. Eine Rekonstruktion von Punktmutationen in den zu „PSST“- und „TYKY“- homologen Untereinheiten, die dem Leigh Syndrom des Menschen zugrunde liegen, wurde in Zusammenarbeit mit Prof. J. Smeitink, Nijmegen, in Y. lipolytica unter­nommen und ergab ähnliche Effekte.

Ausgehend von der schwachen Sequenzähnlichkeit zu [NiFe] Hydrogenasen konnte zum ersten Mal ein Modell für das katalytische Zentrum von Komplex I entwickelt werden. Zur Überprüfung dieses Modells wurden Aminosäurereste in Komplex I, die den Cystein-Liganden des [NiFe] Zentrums und anderen hochkonservierten Aminosäuren in den [NiFe] Hydrogenasen entsprechen, durch gerichtete Mutagenese verändert. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das katalytische Zentrum von Komplex I evolutionär direkt aus dem [NiFe] Zentrum der Hydrogenasen hervorgegangen ist und stützen das von uns entwickelte mechanistische Modell für die direkte Kopplung der Protonen-Translokation und Ubichinon-Reduktion in Komplex I. Die Untersuchung dieser zentralen Aspekte des Reaktionsmechanismus von Komplex I mit Hilfe der FTIR - (Fourier Transform Infra Red) Spektroskopie wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Rich, London, begonnen.

Durch NMR-Untersuchungen an Komplex III aus Rinderherz konnte direkt gezeigt werden, dass am Ubichinon - Oxidationszentrum des Enzyms zwei Ubichinon-Moleküle gebunden werden. Dies stützt das von uns entwickelte Modell, wonach ein „charge-transfer“ Komplex aus zwei Substrat-Molekülen für die Ubichinon-Oxidation durch Komplex III essentiell ist.

Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 und durch ein Doktoranden-Stipen­dium des DFG-Graduiertenkollegs „Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion", sowie durch den Fonds der Chemischen Industrie und eine Kooperation mit der Aventis Crop Science AG, Frankfurt gefördert.

 

Forschergruppe Prof. Dr. Schägger

Der Begriff „Atmungskette“ wird in der Regel für die funktionelle Einheit verschiedener Elektronen- und Protonentransportproteinkomplexe verwendet, die sich unabhängig voneinander in den entsprechenden biologischen Membranen (bakterielle Plasmamembran bzw. mitochondriale Innen­membran) bewegen können. Durch nahezu quantitative Isolierung von Atmungskettenkomplexen in Form von Superkomplexen und durch enzymatische Untersuchungen konnte jedoch kürzlich gezeigt werden, dass die strukturelle Organisation der Atmungskettenkomplexe der einer strukturellen Einheit, einem „Respirasom“, entspricht. Nach Ermittlung der Stöchiometrie der Komplexe I-V in Rinderherzmitochondrien wurde ein Modell der strukturellen Organisation des Systems der oxida­tiven Phosphorylierung entwickelt, das eine solide Grundlage für mechanistische Untersuchungen des OXPHOS-System bietet. Die Techniken der Blau-Nativ- und 2D-Elektrophorese, mit der native Membranproteine und Komplexe direkt aus biologischen Membranen isoliert werden können, wurden modifiziert und erweitert. Diese 2D-Techniken wurden auch in der Diagnostik und biochemischen Analytik von Krankheiten mit Defekten im OXPHOS-System eingesetzt (Kollaboration mit Dr. E. Bertini, Dr. C. Dionisi-Vici, Dr. F.M. Santorelli et al., Bambino Gesú Hospital, Rom). Weitere Forschungsgebiete waren die strukturelle Untersuchung des hydrophilen A1-Teiles einer Archaeon-ATPase (Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Gerhard Grüber et al., Homburg), und die Aufklärung des anaeroben 3-Hydroxybenzoat Stoffwechsels in einem denitrifizierenden Bakterium (Zusammenarbeit mit Prof. Dr. G. Fuchs et al., Freiburg).

Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) und vom Fond der Chemischen Industrie gefördert.