Jahresbericht 1998 des Instituts für Biochemie I (Molekulare Bioenergetik)

1. Mitarbeiter des Ärztlichen-/Wissenschaftlichen Dienstes

Landesbedienstete: Prof. Dr. U. Brandt, Prof. Dr. P. Geck, Prof. Dr. H. Schägger, PD Dr. T.A. Link, Dr. G. Durstewitz, Dr. S. Kerscher, Dr. K. Zwicker, Dipl.-Chem. F. Djafarzadeh, Dipl.-Chem. Kashani-Poor

Drittmittelbeschäftigte: Dipl.-Chem. P. Ahlers, Dipl.-Ing. O. Hatzfeld, Dipl.-Ing. J. Ludwig, Dipl.-Chem. T. Merbitz-Zahradnik, Dipl.-Chem. J. Okun, Dipl.-Chem. O. Tautu

2. Lehre

Über die Pflichtveranstaltungen im Biochemie-Unterricht für Mediziner hinaus wurden folgende Unterrichtsveranstaltungen für Naturwissenschaftler durchgeführt:

- Seminar für Doktoranden zu aktuellen Problemen der Molekularen Bioenergetik

3. Forschung

Forschergruppe Prof. Dr. Brandt:

Die mitochondriale Atmungskette der obligat aeroben Hefe Yarrowia lipolytica ähnelt der Atmungskette der Säugetiere und des Menschen, da sie, im Gegensatz zu der Bäckerhefe Saccharoyces cerevisiae, einen aus mindestens 30 Untereinheiten bestehenden Komplex I enthält. Y. lipolytica wird daher in der Arbeitsgruppe als neuer Modellorganismus zur genetischen Analyse des Komplex I entwickelt.

Aus einer selbst hergestellten genomischen Bibliothek konnten die Gene für sieben nukleär codierte, hochkonservierte Untereinheiten isoliert werden, sie wurden vollständig sequenziert. Für sechs dieser Gene wurden Mutanten durch homologe Rekombination mit einem genetisch markierten Deletionsallel erzeugt. Das gesamte mitochondriale Genom, welches die Gene für sieben weitere hochkonservierte Untereinheiten enthält, wurde kloniert, die Sequenzierung ist etwa zur Hälfte abgeschlossen.

Y. lipolytica besitzt außerdem eine alternative, nicht protonenpumpende NADH-Dehydrogenase. Das Gen für dieses Enzym wurde kloniert, sequenziert und deletiert. Durch Studien an intakten Mitochondrien konnte gezeigt werden, daß Y. lipolytica, im Gegensatz zu anderen Pilzen nur eine externe, jedoch keine interne NADH-Dehydrogenase besitzt.

Der Komplex I von Bos taurus wurde aus mitochondrialen Membranen mit Triton X-100 differentiell solubilisiert und über Hydroxylapatit- und DEAE Biogel A Agarose-Säulenchromatographie in Anwesenheit von Detergenz isoliert. Durch den Wechsel von Triton X-100 auf Laurylmaltosid auf der Biogel A Säule erhielt man einen voll hemmbaren Komplex I mit ca. 80 % Proteinreinheit. Die abschließende Gelfiltration über eine TSKgel G 4000 SW Säule lieferte eine Komplex I Monomerfration von 99 % Proteinreinheit mit einem FMN und 23 Eisen pro Komplex sowie allen aus SMP bekannten Eisen-Schwefel Zentren. Nach Rekonstitution des Komplex I in Liposomen konnte der Aufbau eines Protonengradienten nachgewiesen werden.

Parallel dazu wurde begonnen, ein Reinigungsverfahren für die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus der Hefe Y. lipolytica zu entwickeln. Nach Extraktion der mitochondrialen Membranen mit Laurylmaltosid wird über chromatographischen eine hochreine Enzympräparation erhalten. Der Hefe-Komplex wurde auf seine Untereinheiten-zusammensetzung hin untersucht. In Zusammenarbeit mit Prof. Kühlbrandt (MPI für Biophysik, Frankfurt) wurde begonnen den isolierten Komplex mir Hilfe der kryo-elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalyse zu untersuchen, um Strukturinformationen im Bereich von ca. 20 Å Auflösung zu erhalten.

Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 und durch ein Doktoranden-Stipendium des DFG-Graduiertenkollegs "Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion", sowie durch das Human Frontier Science Program gefördert.

Forschergruppe Prof. Dr. Geck:

In Zusammenarbeit mit H. Petrowski (ZChir) wurden Untersuchungen zu biochemischen Veränderungen während und nach kalter Ischämie bei Rattenlebern fortgesetzt. Methoden zur Messungen der Pyruvatdehydrogenase-Aktivität unter verschiedenen Stoffwechsellagen und in Zellhomogenaten wurden verbessert.

Forschergruppe PD Dr. Schägger:

Die mitochondrialen F₁F_o ATP-Synthase aus Rinderherz wurde unter Bedingungen isoliert, die eine Ablösung sowohl von hydrophoben als auch von hydrophilen ATPase-assoziierten Proteinen vermeiden sollte. In der neuen Präparation wurden zwei bisher nicht bekannte Proteine identifiziert, die derzeit über Sequenzierung und enzymatische Untersuchungen charakterisiert werden.

Bei der Untersuchung der Polypeptidzusammensetzung der vakuolären ATPase aus Rindernebenniere wurden zwei bisher unbekannte Proteine (M9.2 und M8-9) im Membranteil der V-ATPase identifiziert und charakterisiert. Die Strukturähnlichkeit des M9.2 Proteins zu Vma21p, einem Assemblierungsfaktor für die V-ATPase der Hefe, läßt auf ähnliche Assemblierungs-Wege der V-ATPase in Hefen und Säugern schließen. Vma21p ist allerdings nicht im assemblierten Komplex zu finden. Im Gegensatz zu M9.2 verbleibt es in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums.

Defekte im System der oxidativen Phosphorylierung bei mitochondrialen Encephalomyopathien und anderen Krankheitsformen wurden mit einer neuen Micromethode untersucht: mit der Blau-Nativ Elektrophorese und einer anschließenden zweidimensionalen Auftrennung in einem SDS-Gel können OXPHOS-Defekte in 10 mg-Proben von Muskelbiopsien erkannt und quantifiziert werden. Dies führte unter anderem zur Identifizierung von OXPHOS-Defekten bei der Congenitalen Nephropathie des Finnish-Typs, und einer familiären mitochondrialen Encephalopathie mit Makrocephalus und Kardiomyopathie.

Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 und im Normalverfahren gefördert.

Forschergruppe Dr. habil. Link:

Basierend auf der im Vorjahr von unserer Gruppe in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Michel und Dr. S. Iwata (MPI für Biophysik, Frankfurt) aufgeklärten Kristallstruktur des wasserlöslichen Fragmentes des "Rieske"-Proteins des bc₁-Komplexes aus Rinderherzmitochondrien wurden gerichtete Mutanten des "Rieske"-Proteins aus Hefe (in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. B.L. Trumpower, Dartmouth Medical School, Hanover/NH) und aus dem Bodenbakterium Paracoccus denitrificans (in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. B. Ludwig, Biozentrum der Universität Frankfurt) untersucht. Durch Austausch von Resten, die Wasserstoffbrücken zum Eisen-Schwefel-Zentrum bilden, konnte das Redoxpotential des "Rieske"-Zentrums um bis zu 200 mV verschoben werden. Mit einem erniedrigten Redoxpotential korrelierte eine verminderte Elektronentransportaktivität des bc₁-Komplexes.

Aus den Ergebnissen zur Struktur und Elektrochemie des "Rieske"-Proteins im Chinon-Oxidationszentrum des bc₁-Komplexes wurde das funktionelle Modell des "Affinitäts-Wechsel-Mechanismus" abgeleitet. Dieses Modell beruht auf unseren elektrochemischen Untersuchungen, die zeigen, daß das "Rieske"-Protein in Abhängigkeit von seinem Redoxzustand verschiedene Reaktionszwischenstufen unterschiedlich stark bindet und hierdurch die Katalyse der Hydrochinon-Oxidation bewirkt.

Die Arbeiten wurden von der DFG im Normalverfahren und durch ein Doktoranden-Stipendium des DFG-Graduiertenkollegs "Proteinstrukturen, Dynamik und Funktion" gefördert.